BIOTEKNOLOGI MODERN

    Bioteknologi modern menggunakan mikroorganisme-mikroorganisme atau bagian-bagiannya untuk memperbaiki dan meningkatkan kinerja genetik organisme yang dapat dimanfaatkan oleh manusia. Peralatan yang digunakan menggunakan peralatan modern dengan berbagai teknologi misalnya menggunakan mesin isolasi, teknologi bridoma, kloning, rekayasa genetik dan lain-lain. Proses bioteknologi modern dengan proses steril dan mampu memproduksi banyak dalam waktu yang cepat serta dengan kualitas terstandardisasi. Contoh bioteknologi modern adalah sebagai berikut :

1. Kultur Jaringan Tumbuhan

    Kultur jaringan adalah suatu metode dalam mengisolasi bagian dari tanaman seperti sekelompok sel atau jaringan yang ditumbuhkan dengan kondisi aseptik, yang sehingga pada bagian tanaman ini bisa memperbanyak diri, serta dapat tumbuh menjadi tanaman yang lengkap kembali. Untuk prinsip yang akan digunakan dalam menerapkan teknik kultur jaringan ialah dengan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegetatif.

    Yang selama ini dalam teknik untuk perbanyakan tumbuhan dilakukan secara konvensional, maka dalam teknik kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Hal ini berdasarkan teori Kultur In Vitro yakni Totipotensi. Yang teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembang biak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. Oleh karena itu, semua organisme baru yang berhasil ditumbukan akan memiliki sifat yang sama persis dengan induknya.

Dalam hal ini ada beberapa tahap-tahap dalam kultur jaringan diantaranya yaitu:

1. Tahap Persiapan

Yang tahap persiapan ini meliputi yaitu:

Persiapan Ruangan Dan Alat-Alat Yang Akan Digunakan

    Hal ini merupakan tahap awal dan sangat penting karena tahap ini dapat menjadi faktor yang akan menentukan keberhasilan teknik kultur jaringan ini ialah dari tingkat sterilisasi yang tinggi. Demikian pula dengan bahan tanaman dan media tanam yang akan digunakan sebagai eksplan yang bisa diperoleh dari daun, tunas, cabang, batang, akar, embrio, kotiledon ataupun bagian-bagian tanaman lainnya.

Sterilisasi Eksplan

Hal ini dilakukan dengan merendam eksplan dalam larutan kimia tertentu, diantaranya alkohol, NaOCI, CaOCI (kaporit), HgCI2 (sublimat), serta H2O2.

Persiapan Media Tanam

Media tanam yang sangat mendukung pertumbuhan eksplan haruslah mengandung sukrosa dan hara dalam kosenterasi yang cukup. Biasanya media tanam di taruh di dalam botol-botol kaca transparan.

2. Tahap Eksplan Kultur

    Eksplan adalah bagian dari tanaman yang digunakan dalam mikropropagasi atau kultur jaringan tanaman. Seluruh bagian tanaman (daun, batang, dan akar) dapat dipergunakan sebagai eksplan, namun yang biasanya dipergunakan adalah meristem (jaringan muda), mata tunas dan tunas pucuk (shoot tip). Eksplan dapat juga berupa embrio (kelapa), benih (anggrek), biji (sengon), umbi (wortel), keping biji (kotiledon), benang sari dan putik. Eksplan diambil dari tanaman, baik tanaman yang tumbuh di lapang atau tanaman hasil kultur jaringan in vitro. Calon tanaman induk sebaiknya adalah tanaman yang diketahui varietasnya dan dari jenis yang unggul. Tanaman induk dipilih yang sehat dan sedang dalam fase pertumbuhan cepat (bersemi).

    Sebelum dilakukan pengambilan bagian tanaman yang akan dipergunakan sebagai eksplan, tanaman induk yang tumbuh di lapang, perlu disemprot dengan fungisida dan insektisida untuk mencegah serangan hama dan penyakit tanaman. Pembuatan eksplan dari bahan induk dilakukan dengan mempergunakan peralatan yang bersih dan tajam. Eksplan selanjutnya dibawa ke dalam laboratorium untuk dilakukan sterilisasi. Tahapan sterilisasi, bahan sterilisasi, dan durasi sterilisasi tiap jenis eksplan tidak sama, namun secara umum sterilisasi eksplan dilakukan dengan mencuci eksplan dalam air bersih yang mengalir, merendam dalam larutan deterjen, merendam dalam larutan fungisida, merendam dalam larutan sublimat (HgCl2), sterilisasi bertingkat dengan larutan Clorox (pemutih pakaian, Bayclin®), serta pembilasan dengan aquadest steril.

3. Tahap Multiplikasi Tunas

    Pada umumnya eksplan akan membentuk akar pada minggu awal dalam pertumbuhan, lalu dilanjutkan dengan pertumbuhan pada tunas-tunasnya. Yang tunas-tunas tersebut kemudian dipisahkan untuk mendapatkan tanaman yang baru lagi. Multiplikasi tunas dapat dilakukan dengan memisahkan ujuang tunas yang sudah ada yang telah menghasilkan ruas dan buku baru, tunas-tunas lateral, tunas adventif serta dengan cara embrio somatik.

4. Tahap Pemanjangan Tunas, Induksi Akar Dan Perkembangan Akar

    Pada tunas-tunas yang telah dipisahkan kemudian membentuk bagian-bagian tanaman lengkap, termasuk bagian perakaran. Tahapan ini tidak berlaku terhadap tanaman yang mudah berakar. Induksi akar merupakan proses memicu pertumbuhan akar yang biasanya dilakukan dengan penambahan zat pengatur tumbuh terutama dari golongan auxin. Planlet dipindahkan ke media yang mengandung zat pengatur tumbuh.

5. Tahap Media In Vitro

    Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Media yang digunakan biasanya terdiri dari unsur hara makro dan mikro dalam bentuk garam mineral, vitamin, dan zat pengatur tumbuh (hormon). Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti gula, agar, arang aktif, bahan organik lain (air kelapa, bubur pisang, ekstrak buah, ekstrak kecambah).

Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol kaca dan disterilisasi. Komposisi media yang digunakan tergantung dari tujuan dan jenis tanaman yang dikulturkan.

Media tanam kultur jaringan terdiri dari dua jenis yaitu media cair dan media padat. Media cair digunakan untuk menumbuhkan eksplan sampai terbentuk PLB (Protocorm Like Body).

Media padat digunakan untuk menumbuhkan PLB sampai terbentuk planlet (tanaman kecil). Media padat dibuat dengan melarutkan nutrisi dan agar-agar ke dalam akuades dan disterilkan.

Berdasarkan komposisi dan kesesuaian media terhadap jenis tanaman yang akan dikulturkan, dikenal beberapa jenis media dasar:

Media VW yang diformulasikan dan diperkenalkan oleh E. Vacin dan F. Went (1949), untuk tanaman Anggrek

Media MS yang diformulasikan dan diperkenalkan oleh Murashige dan Skoog (1962) untuk berbagai tanaman hortikultura

Media Euwen untuk tanaman kelapa

Media B5 atau Gamborg, digunakan untuk kultur suspense sel kedelai, alfafa dan legume lain.

Media White, untuk kultur akar

Media Woody Plant Madium (WMP) untuk tanaman berkayu

Media N6 untuk tanaman serealia

Media Nitsch dan Nitsch untuk kultur sel dan kultur tepung sari

Media Schenk dan Hildebrandt untuk tanaman berkayu

Media dasar tersebut dapat dimodifikasi sesuai dengan kebutuhan, dengan menambahkan vitamin dan zat pengatur tumbuh (hormon). Zat pengatur tumbuh diperlukan untuk mengatur diferensiasi tanaman. Ada beberapa zat pengatur tumbuh yang biasa dipergunakan dalam kultur jaringan adalah:

Golongan Auxin: IAA, NAA, IBA, 2,4-D

Golongan Cytokinin: Kinetin, BAP/BA, 2 i-P, zeatin, thidiazuron, PBA

Golongan giberellin : GA3

Golongan growth retardan : Paclobutrazol, Ancymidol

Pada umumnya, hormon yang banyak dipergunakan adalah golongan auksin dan sitokinin. Perbandingan komposisi antara kedua hormon tersebut akan menentukan perkembangan tanaman, yaitu:

Auxin ↓ Cytokinin = Perkembangan akar

Cytokinin ↓ Auxin = Perkembangan tunas

Auxin = Cytokinin = Perkembangan kalus

Selain hormon, media kultur jaringan juga harus mengandung vitamin. Vitamin yang biasa dipergunakan dalam media kultur jaringan antara lain: vitamin B12 (thiamin), Nicotinic Acid, vitamin B6 (pyridoxine), dan vitamin E atau C. Pada semua komposisi media kultur jaringan, hormon dan vitamin diperlukan dalam jumlah yang sangat sedikit. Masing-masing komponen media memiliki peran sebagai berikut:

Unsur hara makro : metabolisme tanaman

Unsur hara mikro : pengaturan enzym

Vitamin : regulasi (pengaturan)

Gula atau Sukrosa : karbohidrat, sumber karbon, sumber energi

Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) : merangsang, menghambat atau mengubah pola pertumbuhan dan perkembangan tanaman

Arang Aktif : mengarbsorbsi senyawa fenolik dan untuk merangsang pertumbuhan akar Agar-agar: pemadat

Aquadestilata : pelarut

6. Tahap Aklimatisasi

    Tahapan akhir dari perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah aklimatisasi planlet (tanaman kecil). Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan planlet keluar dari ruangan aseptik. Tahap aklimatisasi merupakan tahap yang sangat penting dan kritis dalam rangkaian budidaya tanaman in vitro, karena kondisi lingkungan di rumah kaca atau rumah plastik dan di lapangan sangat berbeda dengan kondisi di dalam botol kultur. Aklimatisasi dilakukan dengan memindahkan planlet ke media aklimatisasi dengan intensitas cahaya rendah dan kelembapan nisbi tinggi, kemudian secara berangsur-angsur kelembapannya diturunkan dan bibit dari udara luar, sinar matahari langsung dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Media tanaman yang dipergunakan dalam tahap ini biasanya berupa bubuk arang, arang sekam, mos, pakis halus, campuran tanah halus dan kompos, dan sebagainya. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. Selanjutnya bibit siap dipindahkan ke lapang atau lahan penanaman.

Tabel 1. Perubahan Lingkungan in vitro ke lingkungan ex vitro

Lingkungan in vitro Lingkungan ex vitro

Suhu 25 ± 2° C Suhu 23-36° C

Intensitas cahaya 1200-2000 lux Intensitas cahaya 4000-12000 lux

Spektrum cahaya sempit Spektrum cahaya luas

Kelembaban relatif 98-100% Kelembaban relatif 40-80%

Akar hampir tidak berfungsi Akar sangat berfungsi

Sistem fotosintesis hampir tidak berfungsi Sistem fotosintesis sangat berfungsi

Hormon eksogen Hormon endogen

Kondisi steril Kondisi tidak steril

(Sumber : https://www.dosenpendidikan.co.id/tahap-tahap-kultur-jaringan/)

2.KLONING

A. KLONING EMBRIO

    Secara etimologis, kata kloning berasal dari bahasa Yunani "klon" artinya potongan yang digunakan untuk memperbanyak tanaman. Sedangkan secara terminologis, kloning adalah proses pembuatan sejumlah besar sel atau molekul yang seluruhnya identik dengan sel atau molekul asalnya. Dalam bidang genetika kloning merupakan replikasi segmen DNA tanpa melalui proses seksual (Rekombinasi DNA). Proses ini membuka peluang baru dalam terobosan teknologi untuk mengubah fungsi dan prilaku makhluk hidup sesuai dengan keinginan dan kebutuhan manusia.Secara teoritis prosedur dan mekanisme kloning terhadap makhluk hidup melalui empat (4) tahap yaitu isolasi fragmen DNA, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor, transformasi dan seleksi hasil kloning.

    Kloning embrio merupakan usaha untuk menghasilkan individu baru dengan sifat secara genetik sama dengan kedua induknya tanpa melalui perkawinan secara alamiah. Dengan teknik ini, diharapkan dapat diperoleh hewan yang berkualitas baik dan berjumlah banyak dalam waktu yang lebih cepat. Kloning embrio dapat dilakukan pada hewan mamalia, misalnya sapi, kelinci dan domba. (Sumber :Irnaningtias. Biologi Uuntuk SMA/MA Kelas XII. Jakarta: Erlangga)

1) Isolasi fragmen DNA

    Isolasi fragmen DNA yang spesifik dapat dilakukan dengan metode PCR (polymerase chain reaction) yaitu teknik amplikasi fragmen DNA yang spesifik secara in vitro. Secara umum DNA yang digunakan untuk PCR adalah total DNA genom yang diekstraksi dari sel dan tidak membutuhkan tingkat kemurnian tinggi. Urutan DNA yang akan diamplikasi secara spesifik akan ditentukan oleh primer-primer yang tersusun dari nukleotida.(1)

    Material yang diperlukan untuk proses PCR adalah DNA yang mengandung rangkaian urutan yang akan diperbanyak (duplikasi DNA) yaitu primer, DNA polimerase dan campuran dari empat macam deoksiribonukleotida-trifosfat (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) serta MgCl2.

2) Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor

    Proses penyisipan atau penyambungan molekul fragmen DNA dengan molekul DNA vektor disebut ligasi. Biasanya ligasi terjadi antara ujung gugus fosfat dengan gugus hidroksil. Ligasi antara fragmen DNA yang memiliki ujung lengket (cohesive ends) yang komplementer jauh lebih efesien dibandingkan dengan ujung tumpul (blunt ends). Efisiensi ligasi juga dipengaruhi oleh adanya deoksiadenosin tunggal pada ujung. Efisiensi ligasi dapat ditingkatkan, bila fragmen DNA yang memiliki deoksiadenosin tunggal pada ujung bertemu dengan vektor yang memiliki timidin pada ujung.

3) Transformasi DNA

    Transformasi adalah proses pemindahan molekul DNA donor dari lingkungan luar sel. Vektor kloning yang merupakan pembawa gen yang akan dikloning ditransformasi ke dalam sel inang. Transformasi dapat dilakukan secara alami maupun buatan. Pada proses transformasi alami, DNA yang berbentuk untai ganda dan memiliki untaian basa spesifik terhadap protein membran masuk ke dalam bakteri melewati membran sel bakteri terhidrolisis. Pada transformasi buatan, sel bakteri dibuat menjadi sel kompeten secara paksa sehingga selubung sel bakteri bersifat permeabel dan memungkinkan DNA dapat berikatan dengan sel dan masuk ke dalam sitoplasma, kemudian berinteraksi dengan genom sel bakteri.(3)Sel kompeten adalah sel inang yang memiliki kompetensi untuk dimasuki vektor kloning. Perlakuan untuk memasukkan sel kompeten dapat dilakukan dengan menggunakan metode kejutan panas (heat shock) atau kejutan pulsa listrik (metode electroporation).(2)

4) Seleksi hasil kloning

Penyeleksian koloni bakteri untuk mendapatkan kloning yang diinginkan dengan cara X-gal atau pemotongan dengan enzim restriksi. Seleksi dengan X-gal dapat digunakan untuk mengidentifikasi plasmid rekombinan dengan komplementasi. Sedangkan pemotongan dengan enzim restriksi dapat digunakan untuk menyeleksi plasmid rekombinan hasil kloning. Hasil pemotongan tersebut dielektroforesis dan memperlihatkan pita fragmen DNA sisipan yang terpisah dari pita vektor kloning.(4)

Dalam tataran aplikasi, rentetan proses kloning dapat dilakukan dengan mengikuti beberapa langkah berikut ini :

1. Mempersiapkan sel stem, yaitu sel awal yang akan tumbuh menjadi berbagai sel tubuh. Sel ini diperoleh dari makhluk hidup yang hendak dikloning.

2. Sel stem diambil inti selnya yang mengandung informasi genetik kemudian dipisahkan dari sel.

3. Mempersiapkan sel telur, yaitu sebuah sel yang diambil dari makhluk hidup dewasa kemudian intinya dipisahkan.

4. Inti sel dari sel stem diimplimentasikan ke sel telur.

5. Sel telur dipicu supaya terjadi pembelahan dan pertumbuhan. Setelah membelah menjadi embrio.

6. Sel embrio yang terus membelah (blastosis) mulai memisahkan diri dan siap diimplementasikan ke dalam rahim.

7. Embrio tumbuh dalam rahim menjadi janin dengan kode genetik persis sama dengan sel stem donor.(5)

(Sumber : http://greenblue-phinisi.blogspot.com/2009/07/prosedur-dan-mekanisme-kloning.html)

B. KLONING TRANSFER INTI (TRANSPLANTASI INTI)

Domba dolly merupakan hasil kloning transfer inti yang dilakukan oleh ilmuwa dari Skotlandia yang dipimpin oleh Lan Wilmut Pada tahun 1996. Kloning transfer inti yaitu memindahkan inti dari sel donor ke sel yang lain agar diperoleh individu dengan sifat yang sama dengan inti sel donor. Kloning transfer inti bertujuan  menghasilkan individu baru dengan sifat dan jenis kelamin yang sama dalam jumlah banyak. 

Proses kloning transfer inti yang dilakukan pada domba Dolly, sebagai berikut :

1. Sel telur (ovum) di rusak intinya dengan radiasi sinar ultraviolet sehingga tidak memiliki kromosom

2. Sel somatik donor ( berasal dari sel kelenjar susu) hanya diambil intinya

3. Inti dari sel somatik donor dimasukkan ke dalam sel telur dengan bantuan kejutan listrik. Dengan demikian, sel telur mengandung inti dari sel somatik donor berkromosom diploid (2n)

4. Sel telur kemudian membelah beberapa kali membentuk stadium morula

5. Morula kemudian diimplantasikan ke dalam rahim induk betina dan tumbuh secara in vivo (didalam uterus) hingga menjadi bayi domba yang siap dilahirkan.

( Sumber : Irnaningtias. Biologi Uuntuk SMA/MA Kelas XII. Jakarta: Erlangga)

C. BAYI TABUNG

Kloning embrio pada manusia dikenal dengan istilah bayi tabunng. Tekniik bayi tabung dilakukan terhadap pasangan suami istri yang sulit memiliki keturunan karena adanya hambatan pada sistem reproduksi, seperti ketidakmampuan menghasilakan sperma atau sel telur yang subur, dinding rahim wanita yang lemah, terhambatnya fertilisasi atau terhambatnya pertumbuhan embrio di dalam rahim. 

 1. Ovum diambil setelah ovulasi atau langsung dari folikel. Sperma diambil dan dipekatkan. Sampel sperma diambil dan dipekatkan dengan cara membuang cairan seminal. 

2. Ovum dan sperma dimasukkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan melakukan fertilisasi

3. Zigot diambil dari cawan petri untuk diimplantasi

4. Zigot diimplantasi ke endometrium. Zigot akan berkembang secara normal menjadi embrio

Prosedur bayi tabung dapat dijelaskan sebagai berikut:

1. Pasangan suami istri yang sah diambil sel telur dan sel spermanya

2. Sel telur dan sel sperma difertilisasikan secara in vitro dalam tabung yang berisi medium yang sesuai untuk pertumbuhan zigot hingga membentuk morula

3. Morula kemudian diimplantasikan atau ditanam di dalam rahim ibu

4. Di dalam rahim ibu, morula akan tumbuh menjadi blastula, gastrula, hingga menjadi bayi yang siap dilahirkan

(Sumber :Irnaningtias. Biologi Uuntuk SMA/MA Kelas XII. Jakarta: Erlangga)

3. REKAYA GENETIKA

Rekayasa genetika merupakan suatu usaha memanipilasi sifat makhluk hidup untuk menghasilkan makhluk  hidup dengan sifat baru sesuai yang diinginkan. Jenis rekayasa genetika antara lain:

1). Fusi Sel (Teknologi Hibridoma)

    Fusi sel ( teknologi hibridoma ) merupakan proses peleburan atau penyatuan dua sel dari jaringan atau spesies yang sama atau berbeda sehingga dihasilkan sel tunggal yang mengandung gen-gen dari kedua sel yang berbeda tersebut. Sel tunggal ini dinamakan hibridoma yang memiiliki sifat-sifat kedua sel. Fusi sel adalah peleburan dua sel baik   dari spesies yang sama maupun berbeda   supaya terbentuk sel bastar atau   hibridoma. Hibridoma ini sering digunakan untuk memperoleh  antibodi dalam pemeriksaan kesehatan dan pengobatan.Fusi sel diawali oleh pelebaran membran dua sel serta diikuti oleh peleburan sitoplasma (plasmogami) dan peleburan inti sel (kariogami).

Manfaat fusi sel, antara lain untuk pemetaan kromosom, membuat antibodi monoklonal, dan membentuk spesies baru. Di dalam fusi sel diperlukan adanya:

sel sumber gen (sumber sifat ideal);

sel wadah (sel yang mampu membelah cepat);

fusigen (zat-zat yang mempercepat fusi sel).

Contoh ( Penggunaan Teknologi Hibridoma )

Contoh penggunaan teknologi hibridoma ialah produksi antibodi dalam skala besar. Anti bodi ialah protein yang dihasilkan oleh sel limfosit B atau sel T yang bertugas melawan setiap benda asing ( anti gen ) yang masuk ke dalam tubuh. Anti bodi tertentu akan melawan antigen tertentu pula.

Proses Fusi Sel

Dalam proses fusi sel, sel B atau sel T dijadikan sebagai sel sumber gen yang memiliki sifat yang diinginkan yaitu dapat mampu memproduksi anti bodi. Sedangkan sel wadah atau sel target digunakan sel myeloma atau sel kanker yang mampu membelah diri dengan cepat dan tidak membahayakan manusia. Kemudian sel B atau sel T difusikan dengan sel mieloma, untuk mempercepat fusi sel digunakan fusi gen ( zat yang mempercepat terjadinya fusi ).

Contoh Fusi Gen

 

CSCI++, Polietilenglikol ( PEG ), Virus dan NaNO3.

Hasil fusi antara sel limfosit B dengan sel mieloma menghasilkan hibridoma yang memiliki gen penghasil antibody seperti induknya ( sel B ) dan dapat membelah dengan cepat seperti sel mieloma.

Manfaat ( Teknologi Hibridoma )

Manfaat teknologi hibridoma yang lain, misalnya dalam pemetaan genom manusia dan menyilangkan spesies secara genetic dalam sel eukariotik.

Fusi Sel Antibodi Monoklonal

    Antibodi monoklonal diproduksi dengan mengembangkan sel-sel ß limfosit yang hanya mensekresikan satu jenis antibodi. Antigen yang spesifik disuntikkan ke dalam limpa tikus secara invitro menghasilkan sel-sel ß limfosit. Dengan teknik fusi sel-sel ß limfosit digabungkan dengan dengan sel-sel tumor (sel myeloma) menghasilkan sel hibridoma. Fusi sel dapat diperbanyak dengan menggunakan polietilen glikol (PEG), senyawa kimia yang berfungsi untuk membuka membran sel sehingga mempermudah proses fusi sel. Sel hibridoma ditanam pada medium selektif, sehingga berkembang biak. Setelah 10-30 hari sel hibridoma dipisahkan dari campuran dan dibiakkan dalam tabung fermentasi. Antibodi monoklonal yang dihasilkan harus dipisahkan dan dimurnikan.             Penggunaan antibodi monoklonal telah dilakukan secara luas pada bidang kesehatan. Antibodi monoklonal yang spesifik digabungkan dengan perangkat kit untuk tujuan diagnostik, contohnya menyalurkan obat-obatan ke bagian yang sakit, untuk mendeteksi penyakit secara cepat, untuk mendeteksi kehamilan dan pengobatan  penyakit kanker.

Teknik Hibridoma

    Teknik hibridoma adalah teknik pembuatan sel yang dihasilkan dari fusi (penggabungan) antara   sel B  limfosit  dengan sel kanker (jenis mieloma NS-1). Sifat dari sel hibridoma ini adalah immortal (sel abadi karena mampu bertahan hidup, membelah dan memperbanyak diri dalam jumlah tak terbatas dalam media kultur)

Proses Pembuatan Dari Sel Hibridoma

1. proses imunisasi dengan menggunakan antigen  tertentu yang disuntikan ke dalam tubuh  mencit (Mus musculus)

2. sel B-limfosit mencit akan merespon antigen sehingga terbentuk antibodi

pemisahan  sel B-limfosit yang sudah mengandung antibodi dari organ limpa mencit

3. sel B-limfosit kemudian  difusikan dengan sel kanker immortal menghasilkan sel hibridoma

fusi sel hibridoma ini dilakukan dengan membuat membran sel menjadi lebih permeabel sehingga kedua sel bisa menyatu

4. sel hibridoma kemudian diklon pada kultur sel sehingga dihasilkan banyak sel yang memiliki anti bodi tertentu sehingga dikenal dengan antibodi monoklonal yang bisa disimpan lama dalam keadaan dibekukan

5. Fusi sel/teknologi hibridoma = peleburan/fusi dua sel yang berbeda menjadi kesatuan tunggal yang mengandung gen-gen dari kedua sel asli. Sel yang dihasilkan dari fusi ini dinamakan hibridoma (hibrid = sel asli yang dicampur, oma = kanker). Hibridoma ini sering digunakan untuk memperoleh   antibodi dalam pemeriksaan kesehatan dan pengobatan.

    Apabila sel-sel sekali melebur menjadi satu, maka sel-sel ini akan menghasilkan protein yang sangat baik. Misalnya, antibodi monoklonal dapat digunakan untuk mendiagnosis penyakit, tes kehamilan, dan mengobati kanker.

Contoh Fusi Sel =

Fusi sel manusia dengan tikus

Fusi sel tomat dan sel kentang

Fusi sel manusia dengan tikus

Sel limfosit manusia mampu menghasilkan antibodi, tetapi jika dikultur dan dipelihara proses pembelahannya sangat lambat.

Sel manusia tersebut difusikan dengan sel kanker tikus dengan tujuan dapat membelah dengan cepat karena sel tikus mengandung mieloma yang mempunyai kemampuan untuk membelah dengan cepat.

Hibridoma yang terbentuk akan mendapatkan antibodi (sifat sel manusia) dan mampu untuk membelah dengan cepat (sifat sel kanker tikus).

Fusi sel tomat dengan kentang

Fusi sel tumbuhan sering disebut dengan fusi protoplasma.

karena dalam fusi sel antar tumbuhan ini dinding sel tumbuhan yang tersusun atas selulosa harus dihancurkan oleh enzim terlebih dahulu.

maka tinggallah protoplasma untuk difusikan. Misalnya, tanaman tomato, yaitu tanaman baru yang berbuah tomat dan berumbi kentang.

Manfaat fusi sel

    Manfaat fusi sel antara lain untuk pemetaan kromosom, lalu membuat antibody monoclonal dan membentuk spesies baru. Dan di dalam fusi sel diperlukan adanya:

1. Sel sumber gen (sumber sifat ideal).

2. Sel wadah (sel yang mampu membelah cepat).

3. Fusigen (zat-zat yang mempercepat fusi sel)

(Sumber : https://www.gurupendidikan.co.id/fusi-sel/)

2) REKOMBINASI DNA

    Rekombinasi DNA ( rDNA ) adalah suatu upaya meletakkan DNA dari suatu organisme kedalam DNA bakteri dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang biasanya tidak akan  terjadi bersama-sama melalui penyambungan gen. Dalam hal modifikasi genetik, itu diciptakan melalui pengenalan yang relevan DNA ke dalam DNA organisme yang ada seperti plasmid dan bakteri, untuk kode atau mengubah ciri yang berbeda dengan tujuan tertentu seperti resistensi antibiotik. Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak terjadi melalui dalam sel, tetapi di rekayasa. Sebuah protein rekombinan adalah suatu protein yang dihasilkan dari DNA rekombinan.

    Yang salah satu penggunaan pertama DNA rekombinan dalam botani, banyak tanaman yang memiliki genom cukup beradaptasi yang sehingga memungkinkan bagi mereka untuk siap menggabungkan DNA dari spesies yang jauh terkait. Dengan splicing gen baru, para ilmuwan telah mampu mengembangkan tanaman yang tahan terhadap kondisi lingkungan yang ekstrim termasuk kekeringan dan panas. Dalam hal ini juga memungkinkan menggunakan DNA rekombinan untuk mengambil gen dari hewan tertentu dan sambatan dalam genom ada beberapa tanaman untuk membuat tanaman yang mengandung bahan kimia yang membuat mereka tidak menimbulkan selera berbagai hama dan parasit.

Sejarah Rekombinasi DNA

Teknik DNA rekombinan pertama kali di usulkan oleh Peter Lobban, seorang mahasiswa pasca sarjana. Eksploitasi teknologi DNA rekombinan di fasilitasi oleh isolasi, penemuan dan penerapan endonuklease restriksi oleh Werner Arber, Daniel Nathans, dan Hamilton Smith, yang mereka terima tahun 1978 dalam penghargaan nobel dalam kedokteran. Sebuah terobosan dalam penerapan teknologi DNA rekombinan terjadi pada tahun 1977 ketika Herbert Boyer di produksi biosintetik manusia insulin di laboratorium. Urutan gen tertentu atau polinukleotida yang mengkode untuk insulin produksi pada manusia diperkenalkan ke koloni sampel yang E.coli bakteri. Ini adalah obat pertama kali dibuat melalui teknologi DNA rekombinan untuk disetujui oleh FDA dn komersial tersedia dibawah nama merek humulin. Sebagian besar insulin saat ini digunakan diseluruh dunia sekarang biosintetik rekombinan manusia insulin atau analognya.

Metode yang digunakan dalam rekombinasi DNA, diantaranya adalah sebagai berikut:

Metode Transformasi DNA

Merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri. Metode transformasi ini pertama kali dikembangkan untuk memindahkan sifat-sifat genetika yang membawa kenyataan bahwa DNA adalah bahan genetika. Meskipun transformasi telah dieksploitasi untuk mempelajari pautan gen pada berbagai organisme, metode ini sekarang secara luas dipakai untuk mentransfer plasmid-plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya. Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel. Bila molekul DNA yang masuk berupa plasmid, maka replikasi plasmid dapat dimungkinkan dengan genom inang yang baru selama transformasi.

Butuh 3 elemen kunci dari metode transformasi:

Inang yang bersifat stabil

Membutuhkan vector untuk mereplkasikan sendiri

Membutuhkan seleksi dari sel inang yang bias di inersikan dengan gen yang bisa disisipkan

Metode Transduksi DNA

Merupakan suatu proses tranfeksi gen dengan menyisipkan fage (turunan dari bakterio fag lamda yang terdapat didalam virus) atau hamper sama dengan proses transformasi

Metode Konjugasi DNA

Merupakan suatu metode untuk menyatukan gen asing kedalam DNA inang atau Bacterial Artificial Cromosom (BAC). Dasar dari plasmid konjugasi adalah:

Merupakan bagian yang kecil dari episomal bacterial DNA yang memberikan suatu bakteri untuk mampu mengawali proses penyatuan dengan bakteri target.

Batas klloning-nya = 75 – 300 kb.

Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan : Penyebab Mutasi Gen – Pengertian, Alam, Buatan, Faktor, Jenis, Mekanisme, Konsekunsi

Teknologi DNA Rekombinan

    Pengertian Teknologi DNA Rekombinan,  Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk.

    Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

    Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu (Gambar 9.1). Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menja di sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.

Teknik DNA Rekombinan

 Teknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk: mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi.

Teknik-teknik tersebut meliputi:

Teknik untuk mengisolasi DNA

Teknik untuk memotong DNA

Teknik untuk menggabung atu menyambung DNA

Teknuk untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup

 

    Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.

Vektor,berupa plasmid bakteri atau viral ADN virus.

Vektor,berupa plasmid bakteri atau viral ADN virus.

Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan bakteri.

Pemisahan DNA oleh enzim restriksi

Enzim, terdiri dari enzim RESTRIKSI (pemotong plasmid/ADN) dan enzim Ligase (penyambung ptongan-potongan ADN)

Proses produksi insulin manusia dengan rekayasa genetika

Tahapan Rekombinasi DNA

    Teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa teknik diantaranya adalah teknik mengisolasi DNA, memotong DNA, menggabung/ menyambung DNA serta teknik memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan. Adapun langkah – langkah pembuatan DNA rekombinan menurut Moeljopawiro adalah sebagai berikut:

1. Isolasi sumber DNA

    Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Fragmen DNA yang tidak tercampur dengan fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa tahap. 

    Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR, yang dilanjutkan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose yang mengandung fragment tersebut. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada membran Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat.

2. Pemotongan Gen

    Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu sesuai yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim, yaitu: enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai “gunting” untuk memotong DNA pada situs spesifik. Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempat-tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya.

    Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut “sticky” (mudah lengket) atau kohesif.

3. Penggabungan Gen

    Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).

    Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen. Kecocokan yang sangat spesifik dibutuhkan bila fragmen DNA yang akan disambungkan mempunyai ujung tidak rata (sticky end), karena penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T berpasangan dengan A dan G berpasangan dengan C. Sedangkan fragmen DNA yang mempunyai ujung rata (blunt end) dapat disambungkan dengan sembarang fragmen DNA lain yang berujung rata. Oleh karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak memerlukan spesifikasi tertentu menggunakan ujung rata (Suharsono, 2000).

4. Penyisipan Gen ke dalam Bakteri

Penyisipan gen dapat dilakukan melalui dua cara yaitu:

 

Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya

(sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel

Transformasi : pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya.

Transduksi : cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui

perantara fage.

DNA yang masuk ke dalam bakteri dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan. Adapun proses rekombinasi DNA dari pemotongan hingga penggabungan seperti yang ditampilkan pada gambar berikut:

    

                                                    Penyisipan Gen ke dalam Bakteri

5. Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target

Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target / Sel Hidup dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu:

Transformasi : pengambilan DNA rekombinan dari lingkungan di sekelilingnya.

DNA-packaging : memasukkan molekul DNA-phage ke dalam partikel phage.

Minkroinjection : memakai jarum super kecil untuk menginjekasikan DNA rekombinan langsung ke inti sel yang ditransformasi.

Adapun proses pemasukan DNA rekombinan ke dalam sel target, misalnya pada tumbuhan dapat ditampilkan seperti gambar berikut:

Aplikasi dan Manfaat DNA Rekombinan

Teknologi rekombinan DNA banyak diaplikasikan dalam kehidupan sehari-hari baik dalam bidang kesehatan, pertanian, kelautan, hukum dan ilmu pengetahuan. Berikut adalah contoh aplikasi dan manfaat teknologi rekombinan DNA pada bebrapa bidang kehidupan :

Bidang Kesehatan

a. Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetis.

b . Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri c. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).

d . Therapi gen untuk penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit- penyakit keturunan (genetic disorders) dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan gen (misal: kanker)

Bidang Pertanian

a. Bakteri Ice- (ice minus): bakteri yang telah direkayasa sehingga tidak membeku pada suhu rendah. Digunakan (disemprotkan) pada tanaman agar tanaman tidak membeku di musim dingin.

b. mikroba pendegradasi limbah.

c. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat Bt

d. Tanaman tahan herbisida.

Bidang Kelautan : penggunaan hormon pertumbuhan untuk meningkatkan ukuran ikan

Bidang Hukum

a. Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi dengan menggunakan analisis Sidik Jari DNA misalnya: kasus perkosaan

b. Untuk menentukan keturunan dan keluarga berdasarkan DNA fingerprint.

Bidang Ilmu Pengetahuan

a. Membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia (penyakit genetik) misalnya kanker payudara

b. Kemajuan Teknologi DNA telah mendorong para ilmuwan (konsorsium ilmuwan internasional) untuk mewujudkan proyek genom manusia dan genom organisme lainnya.

Fungsi DNA Rekombinan

    Dalam pemberian vaksin melalui DNA rekombinan juga mungkin, dalam rangka untuk menciptakan vaksin ini, virus tuan rumah, seperti virus herpes, DNA-nya telah dihapus dan diisi dengan DNA rekombinan yang berisi coding untuk membuat antibodi untuk penyakit tertentu. Meskipun teknologi ini relatif baru, telah terbukti cukup berhasil dan ilmuwan berharap bahwa hal demikian bisa dikembangkan lebih lanjut untuk membuat vaksin untuk berbagai penyakit yang saat ini tidak memilikinya. Hal ini juga memungkinkan untuk menggunakan teknologi DNA rekombinan untuk menyembuhkan pasien dari beberapa penyakit. Ada banyak kondisi yang disebabkan oleh urutan DNA yang rusak yang dapat diganti dengan bagian yang sehat dari DNA yang diberikan kepada pasien, biasanya melalui pengiriman virus. 

    Yang dalam penelitian menunjukkan bahwa penyakit seperti fibrosis kistik dan anemia sel sabit mungkin baik satu hari diobati dan dicegah melalui perubahan struktural untuk DNA seseorang. Teknologi untuk menyembuhkan penyakit ini masih dalam pengembangan, namun hasil awal yang cukup menjanjikan. Dalam pasien tidak memiliki urutan DNA yang membuat atau mengenali kebutuhan untuk enzim tertentu juga bisa mendapatkan keuntungan dari perawatan DNA rekombinan. Yang dalam kasus ini, sebuah untai DNA yang menciptakan protein khusus yang dibutuhkan untuk melakukan tugas tertentu dapat dimasukkan ke dalam DNA seseorang. Bagi banyak jenis kondisi, bagian yang rusak dari DNA tidak perlu diganti oleh DNA rekombinan, sebagai DNA baru hanya dapat ditempelkan ke untai normal. Bagi penderitan diabetes yang mengambil insulin memanfaatkan teknologi DNA rekombinan seperti ini karena insulin yang diproduksi dengan menggunakan jenis teknologi.

Plasmid

Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. Plasmid tersebar luas diantara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi. Plasmid bias juga disebut substansi yang kecil bentuk sirkuler, merupakan ekstra kromosomal DNA molekul yang terdapat di dalam bakteri dan dapat mereplikasi dirinya sendiri diluar sel inang. Tingkat pertumbuhan dari plasmid tersebut, cepat dan batas kemampuannya untuk cloning adalah 0,1 – 10 kb. Plasmid yang hanya berisikan transgen berfungsi untuk mengawali proses penggabungan.

Plasmid dapat dibedakan menjadi plasmid resisten, cold plasmid, plasmid degratif, dan plasmid virulen.

Plasmid Resisten

Yaitu plasmid yang hanya berisi gen dan hanya dapat mengakibatkan suatu resistensi dalam melawan zat anti biotika/racun.

Cold Plasmid

Yaitu plasmid yang berisi tentang gen yang berisi kode untuk menentukan produksi, misalnya colin, protein, yang dapat membunuh bakteri

Plasmid Degratif

Yaitu plasmid yang mampu memotong suatu substansi yang spesifik, misalnya touole, kelenjar saliva, dll.

Plasmid Virulen.

Yaitu plasmid yang terdapat didalam bakteri pathogen. contohnya dalam bakteria Salmonella, dapat menyebabkan penyakit.

(Sumber : https://www.gurupendidikan.co.id/rekombinasi-dna/)